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关于印发《环境与化学工程学院BSL-1微生物实验室标准操作规程(SOP)》的通知

发布日期:2026-07-03 10:46 阅读次数:

环化实验〔2026〕8号


全院教职工:

学院结合实际情况,制定了《环境与化学工程学院BSL-1微生物实验室标准操作规程(SOP)》,且已经学院党政联席会议审议通过,现印发给你们,请遵照执行。




五邑大学环境与化学工程学院

2026年5月22日





环境与化学工程学院

BSL-1微生物实验室标准操作规程(SOP)

一、总

(一)目的

建立实验室生物安全管理体系,规范实验操作流程,防止病原微生物泄漏或实验室获得性感染,保障实验人员、周围环境及公众的安全。

(二)适用范围

本规程适用于我院生物安全一级(BSL-1)实验室。该级别适用于操作已知不会对健康成人引起疾病的、对人和环境潜在危害最小的微生物因子(如非致病性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)。

二、人员准入与管理

实验人员必须经过生物安全培训,熟悉标准微生物操作规范,了解潜在风险。所有实验工作必须在受过微生物学或相关科学训练的科学工作者监督下进行。实验期间限制非必要人员进入。儿童、孕妇、免疫低下者及无关访客不得进入。

三、标准微生物操作规范(核心要求)

(一)一般行为规范

严禁在实验区内饮食、饮水、吸烟、化妆等。食物及个人生活用品必须存放在指定区域(如办公室或专用储物柜),严禁放入实验操作区或试剂冰箱。不得戴手套触摸脸、手机、门把手、电梯按钮等公共区域。长发必须束起,不佩戴首饰、挂件。严禁用口吸移液,必须使用移液辅助器。

(二)个人防护装备

1.防护服

类型要求:长袖、扣紧式,材质为棉或涤棉。

穿着规范:进入实验室前必须穿好,扣好或拉好全部扣子/拉链。袖子不得卷起,袖口应覆盖腕部。

脱卸与存放:离开实验室时立即脱下,内面朝外折叠或悬挂于指定挂钩/衣架。不得穿实验服进入走廊、办公室、会议室、食堂、卫生间等非实验区域。

清洗与更换:每周至少清洗一次,或明显污染后立即更换。污染实验服不得带回家清洗,应交由实验室统一处理或送洗。

2.手套

选型:一次性丁腈或乳胶手套,无粉为佳。

佩戴前检查:吹气或拉伸检查有无破损、针孔。

使用规范:袖口应覆盖防护服袖口外;接触活菌、样本或污染表面后应立即更换;手套破损、明显污染后立即摘除并洗手。

摘除与处置:采用“外翻法”摘除,避免外表面接触皮肤。废弃手套投入生物废弃物专用垃圾袋。严禁清洗或重复使用一次性手套。

3.眼部防护:在进行任何可能产生液体飞溅或气溶胶的操作(如移液、振荡、离心、倾倒菌液)时,必须佩戴防溅护目镜或面罩。

4.鞋具:不露脚面、防滑、低跟。禁止穿凉鞋、拖鞋、高跟鞋、洞洞鞋进入实验室。

(三)操作规范

1.减少气溶胶与飞溅

所有操作均应谨慎进行,包括移液、混匀、离心、接种环蘸菌等,应尽量减少气溶胶和飞溅物的产生。

移液:使用微量移液器时,吸头垂直插入液面下,缓慢吸液。避免剧烈吹打,防止产生气泡。含菌液体不得从高处倾倒,应沿容器壁缓慢加入。

混匀:使用涡旋振荡器时,必须加盖或使用密封管。禁止用手剧烈摇晃含菌液体的开口容器。

离心:离心前检查离心管盖是否拧紧。使用密封转子或加盖吊篮。离心结束后静置1—2分钟再开盖。

接种环蘸菌:接种环使用前后必须灼烧灭菌(如使用明火,需确保周围无易燃物)。划线动作轻缓,避免培养基飞溅。

2.锐器管理

替代原则:优先使用塑料移液管、塑料吸头、塑料接种环等,尽量使用一次性塑料器皿代替玻璃器皿。

玻璃器皿检查:使用前检查有无裂纹、缺口、毛边。破损玻璃器皿不得继续使用,立即弃入防穿刺锐器盒。

破碎玻璃处理:不得用手直接拾取,使用刷子、簸箕、镊子或防刺手套收集。碎片弃入防穿刺锐器盒。

针头与注射器:严禁回套针帽;严禁拆解、弯曲、折断针头。使用后立即整体弃入防穿刺锐器盒。

锐器盒管理:放置于操作区域触手可及处。不得超过3/4满,封闭后按规定处理。严禁将非锐器废弃物投入锐器盒。

3.样本与菌种管理

所有培养物、样本和菌种容器必须有明确标识,至少包含名称(或编号)、日期和操作人姓名。样本接收时需核对信息并检查包装完整性,菌种入库应登记来源、代次、数量和存放位置。样本和菌种应按要求分区存放,遵循“先入先出”原则取用。每次使用后须在相应记录表上登记取用日期、用途和操作人。菌种传代时应标注新代次,且不得超过规定最大代次。转移样本或菌种时,容器必须加盖密封并置于二级容器中;若转移至外部,须执行三层包装并附交接单。过期、用完或无需保留的样本和菌种须经高压灭菌或化学消毒后销毁,并在销毁记录中登记。所有记录应可追溯,保存至少2年。

四、消毒灭菌与废弃物处理

(一)环境消毒

1.日常消毒:每日工作结束后,以及任何活菌物质发生溢洒后,必须立即使用有效消毒剂擦拭工作台面。

2.设备消毒:离心机、培养箱、生物安全柜等设备内表面应定期清洁消毒。

3.消毒剂选择:常用75%乙醇(作用时间≥1分钟);溢洒处理使用0.1%次氯酸钠(有效氯1000ppm,作用时间≥10分钟);设备内表面使用75%乙醇或季铵盐类消毒剂。

(二)消毒剂管理

次氯酸钠溶液现配现用,有效期为24小时,配制后应在容器上标注:名称、浓度、配制日期、有效期、配制人。75%乙醇可使用预配商品。消毒剂应储存于阴凉避光处,不得与酸、碱、还原剂混放。容器应密闭,防止挥发。过期或失效消毒剂应按化学品废弃物处理,不得倒入下水道(大量时)。

(三)废弃物处理

1.所有微生物培养物、储存菌株及相关废弃物,在排放或丢弃前必须进行灭活处理(首选高压蒸汽灭菌法)。

2.对于需转移至其他地点进行消毒的物料,必须置于坚固、防漏的容器内密封运输。

3.废弃的针头、注射器、碎玻璃等必须弃置于防穿刺锐器盒中。

(四)洗手

操作活菌材料后、摘除手套后、离开实验室前,必须使用抗菌洗手液在洗手池彻底洗手。

五、设施维护与应急处理

(一)环境设施要求

1.环境维护:实验室应便于清洁,地面不建议铺设地毯。实验台面应防水、耐热、耐酸碱及消毒剂腐蚀。

2.基础设施:每个实验室应在出口处设置洗手池,配备洗手液、消毒液(如速干手消毒剂)等清洁用品。

3.标识:实验室入口处必须张贴生物危害标识,注明实验室负责人姓名、联系电话、学校紧急联系电话等信息。标识应清晰、醒目。

(二)事故应急处理

1.皮肤接触:立即脱手套,肥皂水/清水冲洗≥15min,必要时消毒。

2.黏膜/眼接触:洗眼器冲洗≥15min,就医。

3.溢洒:覆盖含氯消毒剂→作用30min→清理→消毒台面。

4.锐器刺伤:挤血→冲洗→消毒→报告、登记、就医。

5.报告:所有事故立即报告实验室负责人与实验中心。

六、附则

(一)本规程自发布之日起生效。

(二)本规程解释权归五邑大学环境与化学工程学院实验中心所有。


附件:1.移液管和移液辅助器使用规程

      2.尖锐利器使用规程

      3.样本进出实验室操作规程

      4.洗手操作规程

      5.菌种使用操作规程



附件1


移液管和移液辅助器使用规程


在BSL-1实验室中,移液管和移液辅助器是用于精确转移微生物培养物、试剂或液体样本的核心工具,其规范使用直接关系到实验准确性和生物安全。本规程基于BSL-1实验室风险等级,明确操作流程、清洁消毒及应急处理要求,适用于所有涉及微生物液体转移的实验活动。

一、适用范围

本规程适用于BSL-1实验室中以下场景的移液操作:

微生物菌液、培养基的转移(如接种、稀释、分装);

含低风险微生物的液体样本处理;

实验用试剂(如缓冲液、染色剂)的移取。

禁止使用移液管转移:腐蚀性极强的化学试剂(如浓酸、浓碱)、易挥发有毒气体或超出移液管量程的液体。

二、操作前准备

(一)工具选择与检查

1.移液管:根据移液体积选择合适量程(如 1mL、5mL、10mL),确保无破损、刻度清晰,且为灭菌后专用(一次性移液管需包装完好,可重复使用移液管需经高压灭菌)。

2.移液辅助器:检查电池电量(电动款)或吸力是否正常(手动款),确认连接部位密封良好,表面无污染或破损。

3.配套工具:准备无菌吸头(若使用刻度移液管,需搭配对应的橡胶吸球或移液辅助器接口)、消毒酒精棉片、废液缸。

(二)个人防护与环境准备

操作人员需按BSL-1要求穿戴实验服、手套,若移液体积较大(如≥10mL)或可能产生飞溅,需额外佩戴护目镜。实验台需清洁消毒,将移液管、移液辅助器、待移液体及接收容器按 “就近原则” 摆放,避免操作中手臂大幅移动。

三、移液操作步骤

(一)一次性移液管与移液辅助器配合使用

1.安装移液管:打开一次性移液管包装(仅触碰管口非刻度端),将移液管顶端插入移液辅助器的接口,旋转固定(确保无松动,防止漏液)。

2.吸液操作:手持移液辅助器,将移液管尖端垂直伸入待移液体中(液面下 1~2cm,避免触碰容器壁);缓慢按压移液辅助器的吸液按钮(或捏动手动吸球),使液体缓慢上升至刻度线以上约0.5cm处,避免吸空或液体进入移液辅助器内部;暂停吸液,将移液管移出液面,用滤纸轻擦移液管外壁(仅擦除多余液体,不触碰尖端)。

3.调平刻度:保持移液管垂直,视线与刻度线平齐,缓慢释放移液辅助器按钮,使液体凹液面最低点与目标刻度线对齐。

4.放液操作:将移液管尖端靠在接收容器内壁(倾斜 45°角),缓慢按压排液按钮,使液体自然流出;液体完全排出后,保持移液管尖端接触容器内壁1—2 秒,确保无残留;若为“吹出式”移液管(管口标有“吹”字),需按动辅助器的“吹出”按钮,将残留液体吹尽。

(二)可重复使用移液管的特殊要求

1.需经121℃高压灭菌20—30分钟后使用,灭菌后存放于无菌容器中,取用时光握移液管顶端,避免污染刻度区和尖端。

2.吸液时必须使用移液辅助器,严禁用嘴吸移液管(即使是无菌液体,也需避免交叉污染和误吸风险)。

四、操作后处理

(一)移液管处置

1.一次性移液管:使用后立即将尖端朝下放入含氯消毒剂(1000mg/L)的废液缸中,完全浸没30分钟后,取出放入高压灭菌袋,经灭菌后作为垃圾处理。

2.可重复使用移液管:使用后先浸泡于含氯消毒剂(500mg/L)中30分钟,再用清水冲洗干净,烘干后包装灭菌,备用。

(二)移液辅助器清洁与存放

1.表面消毒:每次使用后,用75%酒精棉片擦拭移液辅助器的手柄、接口及按键,重点清洁可能接触液体的部位。

2.污染处理:若移液过程中液体意外进入接口,需立即拆开可拆卸部件,用 75% 酒精冲洗内部,晾干后再使用;若污染严重,需整机消毒或更换部件。

3.存放:清洁后将移液辅助器放置于干燥、洁净的实验台区域,避免与试剂或培养物直接接触。

(三)实验台清洁

移液结束后,用75%酒精擦拭操作区域,若有液体溅出,按BSL-1应急处理流程消毒。

五、注意事项

1.移液过程中保持平稳操作,避免快速吸液或排液,减少气溶胶产生(尤其对微生物菌液)。

2.移液管尖端若触及非无菌表面(如实验台、未消毒的容器外壁),需立即更换新移液管,避免污染样本。

3.不同浓度或种类的液体需使用不同移液管,严禁混用(如移取菌液后不可直接移取无菌试剂)。

4.移液辅助器需定期检查(每周1次),确保吸力正常、无漏液,电动款及时充电,避免操作中断。

六、应急处理

1.移液管破碎:若移液管在容器内或实验台破碎,立即停止操作,佩戴新手套,用镊子夹取碎片(避免徒手接触),放入锐器盒;污染区域用含氯消毒剂擦拭消毒15分钟后清理。

2.液体泄漏至移液辅助器内部:立即停止使用,将辅助器拆开,用含氯消毒剂(1000mg/L)浸泡可拆卸部件30分钟,清水冲洗后晾干;不可拆卸部分用酒精反复擦拭,确认无残留后再使用。

3.液体飞溅至皮肤/黏膜:按BSL-1应急处理要求,皮肤接触用肥皂水冲洗+酒精消毒;眼睛接触立即用洗眼器冲洗15分钟,必要时就医。



附件2


尖锐利器使用规程


在BSL-1实验室中,尖锐利器(如针头、玻璃碎片等)若使用或处理不当,可能导致人员刺伤、划伤,甚至引发微生物间接暴露风险。本规程针对BSL-1实验室常见尖锐利器,明确其使用、处置及应急处理要求,旨在预防意外伤害和交叉污染。

一、适用范围

本规程适用于BSL-1实验室中所有涉及以下尖锐利器的操作:

注射类:一次性注射器针头、穿刺针;

玻璃类:玻璃移液管、载玻片、盖玻片、玻璃培养皿碎片;

刀具类:剪刀(刃口锋利部分);

其他:除以上三类外,具有尖锐边缘或尖端的物品。

二、使用前准备

(一)利器选择与检查

1.根据实验需求选择合适类型的尖锐利器(如移液时优先使用塑料移液管,减少玻璃利器使用);

2.检查利器完整性:玻璃制品需无裂痕、无缺口;针头需无弯曲、无倒刺;刀具需刃口完好,避免使用破损利器。

3.一次性利器需包装完好、在有效期内;可重复使用利器(如金属解剖针)需经灭菌处理(121℃高压灭菌20—30分钟)。

(二)防护与环境准备

1.必须佩戴一次性手套,操作玻璃利器或刀具时可选择加厚手套;若操作涉及液体飞溅(如用针头抽取菌液),需额外佩戴护目镜。

2.实验台需清理无关物品,将利器放置在稳固区域(如专用托盘内),避免边缘悬空;利器与待处理样本、试剂的摆放需保持安全距离,防止误碰。

三、操作规范

(一)玻璃类利器使用

1.玻璃移液管

取用时避免单手抓取多支,防止滑落破碎;若需折断玻璃移液管,需使用专用锉刀划刻,并用纸巾包裹两端后折断,避免徒手直接操作。移液过程中保持平稳,若玻璃移液管接触非无菌表面(如实验台边缘),需立即停止使用,按污染利器处理。

2.载玻片与盖玻片

放置样本时轻拿轻放,避免用力按压导致碎裂;染色或观察后,若需清洗重复使用,需放入专用防漏容器(内垫软布),避免相互碰撞产生碎片。

(二)注射类利器使用

1.针头与注射器

仅在必要时使用(如抽取少量菌液注射至培养基),优先采用无针转移技术(如移液器);安装针头时旋转固定,避免用力掰扯;使用后立即套上针头保护帽(采用“单手回套法”:一手持注射器,另一手用镊子夹取保护帽套回,禁止双手操作)。严禁重复使用一次性针头,禁止用针头挑刺、搅拌或替代其他工具。

(三)刀具类(剪刀)利器使用

握持时刀刃朝向远离自身和他人的方向,移动过程中保持刃口向下;剪切样本时用力均匀,避免突然用力导致打滑。暂时不使用时,将刀具放置在专用刀架上,禁止直接放在实验台边缘。

(四)通用操作原则

1.禁止将尖锐利器随意传递给他人(需放在托盘内传递);禁止在实验台边缘摆弄利器;

2.操作时集中注意力,避免分心(如接电话、交谈时需暂停操作,将利器放回安全位置);

3.若利器沾染微生物培养物,需先在实验台消毒区域进行表面消毒(75% 酒精擦拭),再进行后续处理。

四、使用后处理

(一)利器收集容器要求

必须使用专用防刺穿、防泄漏的锐器盒;锐器盒需放置在实验台易取用且不易碰倒的位置,容积不超过 3/4 时需及时密封更换。

(二)分类处置流程

1.一次性利器:使用后立即放入锐器盒,禁止随手丢弃在普通垃圾桶或水槽中。具体操作:

2.针头:无需拆卸,连同注射器一起放入锐器盒(若仅丢弃针头,需用专用针头回收器分离);

3.玻璃碎片:用镊子夹取(禁止徒手捡拾),放入锐器盒;

4.污染刀具:用酒精消毒后放入锐器盒(一次性)或专用灭菌容器(可重复使用)。

5.可重复使用利器:使用后先浸泡于含氯消毒剂(1000mg/L)中30分钟,再用镊子取出,经高压灭菌后清洗、烘干,存放于无菌容器中备用。

(三)锐器盒最终处置

密封后的锐器盒需标注 “灭菌日期”“处理人”,经121℃高压灭菌30分钟后,交由具备资质的医疗废弃物处理机构处置,处置记录保存至少3年。

五、应急处理

(一)刺伤/划伤处理

1.立即停止操作,挤出血液:用肥皂水或流动清水冲洗伤口5—10分钟,从伤口近心端向远心端轻轻挤压,尽可能排出污血(禁止直接挤压伤口);

2.消毒伤口:用75%酒精或碘伏擦拭伤口及周围皮肤,覆盖无菌纱布;

3.报告与记录:立即向实验室负责人报告,记录刺伤/划伤时间、利器类型、涉及微生物种类(若有),并观察24—48小时,若出现红肿、疼痛等症状及时就医。

(二)利器掉落或破碎

1.若利器掉落地面,禁止直接用手捡拾,需先在周围放置警示标识(如“小心玻璃”);

2.戴厚手套或用镊子夹取,若为玻璃碎片,可先用硬纸板收集,再放入锐器盒;

3.污染区域用含氯消毒剂(1000mg/L)擦拭消毒2次,作用15分钟后清理。

六、管理要求

(一)专人负责

实验室需指定专人管理尖锐利器,定期检查锐器盒存量、容器完整性,确保及时更换。

(二)培训与考核

所有操作人员需接受尖锐利器安全使用培训,掌握刺伤应急处理流程,考核合格后方可上岗。

(三)减少使用原则

优先采用替代工具(如塑料移液管替代玻璃移液管、安全型针头替代普通针头),降低利器暴露风险。



附件3


样本进出实验室操作规程


在BSL-1实验室中,样本(包括微生物菌液、环境样本、实验后残留样本等)的进出流程直接影响实验安全性和数据准确性。本规程明确了样本从接收、登记、传递到外送的全流程规范,适用于所有进入或离开BSL-1实验室的低风险样本,旨在预防样本污染、信息混淆及意外泄漏。

一、样本接收与准入

(一)核对信息

接收样本前,核对申请单信息(样本编号、类型、数量、检测项目)与样本标签是否一致。不一致或破损的样本按异常处理。

(二)包装检查

确认样本容器为防漏材质,无破损、无渗漏。外层应有二级容器(如密封袋、带盖塑料盒)。

(三)外部清洁

若外包装有可见污染,用75%酒精或适当消毒剂擦拭外表面,待干后转移。

(四)个人防护

操作人员需穿着实验服、佩戴手套(一次性丁腈或乳胶)。必要时戴护目镜(如可能产生气溶胶时)。

(五)登记入库

在《样本接收登记表》上记录接收日期、样本状态、操作人。

二、样本内部传递与暂存

(一)转运

在实验室内移动样本时,必须加盖并置于稳固试管架或密封容器中。禁止手持无盖容器走动。

(二)暂存

按样本要求存放(室温、4℃或-20℃)。冰箱/冰柜内样本需分区存放(待检区、已检区、废弃物区),并明确标识,不同来源的样本之间保持距离,避免交叉污染。

(三)避免污染

打开样本管动作轻柔,在生物安全柜(若无,则在实验台远离人员走动区域)操作。用后的样本管盖应朝向桌面外侧,避免内部污染桌面。

三、样本使用与操作

(一)减少气溶胶

禁止用注射器与针头混合液体(除非必要);使用移液器缓慢吸液;离心前确认离心管盖紧;离心后静置1—2分钟再开盖。

(二)防止交叉

每次只打开一个样本管。不同样本使用不同加样枪头。操作完一个样本后,及时清理台面。

(三)及时记录

使用后立即在《生物样本使用记录表》上做好记录,内容包括样本唯一编号、名称、使用日期、使用人、数量、用途、剩余数量及去向等。

四、样本送出(含销毁或归还)

(一)灭活处理

实验后的废弃样本(如剩余培养物),需在实验室现场进行化学消毒(如用含氯消毒剂终浓度0.1%~0.5%浸泡30分钟)或高压灭菌(121℃,20—30分钟)。只有灭活后的样本才能作为普通医疗废物处理。

(二)包装送出

如需将未灭活样本送其他部门,必须遵循“三层包装”原则:

内层:防渗漏主容器(样本管)。

中层:吸收性材料(如吸水纸)包裹主容器,置于防漏第二容器(密封袋或带盖塑料罐)。

外层:带生物危害标识的转运箱。

表面用消毒剂擦拭后,附上样本交接单。

(三)归还外单位

若样本需返还送检单位,同样执行三层包装,并附COA(分析证书)及生物安全声明(说明已知为BSL-1风险等级)。

五、应急处理

(一)小范围溢洒(直径<10cm)

1.用吸水纸巾覆盖溢洒区。

2.从外围向中心倾倒适量消毒剂(如1%次氯酸钠),作用15分钟。

3.清理后再次擦拭消毒。

(二)个人暴露

皮肤接触样本——立即用肥皂和流水冲洗15分钟;

眼睛溅入——用洗眼器或生理盐水冲洗15分钟,必要时就医。

(三)报告

任何溢洒或暴露事件均需报告实验室负责人,并填写《异常事件记录表》。

六、记录与管理

所有样本的接收、传递、外送、储存记录需至少保存3年,电子记录需备份。实验室每月对样本库存进行盘点,清理过期或无用样本。

新入职人员需接受样本管理培训,考核合格后方可参与样本接收或传递操作。



附件4


洗手操作规程


在BSL-1实验室中,手部是微生物传播的主要途径之一。规范的洗手操作能有效减少手部携带的微生物,降低实验人员意外暴露风险,是保障个人安全和实验环境洁净的基础环节。本规程明确洗手的时机、步骤及注意事项,适用于实验室所有人员在实验相关活动中的手部清洁。

一、适用场景

实验人员在以下情况必须严格执行洗手操作:

进入实验室后,开始实验操作前;

接触微生物培养物、污染样本、实验废液或尖锐利器后;

脱卸个人防护装备(如手套、实验服)后;

实验操作过程中手套破损或手部被液体溅湿后;

离开实验室前;

进食、饮水、触摸面部(如揉眼睛、擦鼻子)前(若在实验间隙进行此类活动,需先洗手并离开实验区)。

二、洗手设施与用品要求

(一)设施配置

1.实验室入口或实验区附近需配备洗手池;

2.洗手池水流需温和(避免水花飞溅),下方放置专用接水盆,排水通畅;

3.配备干手设备(如一次性纸巾),禁止使用公用毛巾。

(二)清洁用品

1.可使用抗菌肥皂或抗菌洗手液,置于按压式容器中(避免徒手接触皂体);

2.若实验区无水源,可备用75% 酒精免洗洗手液(仅作为临时替代,有条件时需补充水洗)。

三、洗手操作步骤(“七步洗手法”)

(一)湿润双手

打开水龙头,用流动清水将双手(掌心、手背、指缝、指尖)完全湿润(水温以舒适为宜,避免过烫)。

(二)涂抹肥皂或洗手液

取适量肥皂或洗手液,双手揉搓至产生丰富泡沫,确保覆盖手部所有区域。

(三)七步揉搓(每步至少15秒,总时长≥20秒)

第一步(掌心相对):双手手指并拢,相互揉搓掌心;

第二步(手背交替):一手掌心贴另一手手背,十指交叉,相互揉搓,随后交换;

第三步(指缝相对):双手掌心相对,十指交叉,揉搓指缝;

第四步(弯曲指关节):一手握住另一手的手指,旋转揉搓指关节及指尖(包括指甲缝),随后交换;

第五步(拇指环绕):一手握住另一手的拇指,旋转揉搓,随后交换;

第六步(手腕交替):一手揉搓另一手的手腕,随后交换;

第七步(指尖立掌):双手指尖并拢,立在掌心处揉搓(重点清洁指甲下方)。

(三)冲洗干净

用流动清水将双手彻底冲洗,确保肥皂泡沫完全冲净(冲洗时指尖向下,避免污水倒流至手臂)。

(四)擦干双手

用一次性无菌纸巾按压吸干水分(从指尖到手腕,避免用力摩擦),或使用烘手器(距离手部10~15cm,烘干时间≥30秒)。

(五)关闭水龙头

用擦手后的纸巾包裹水龙头手柄关闭,避免手部再次污染。

四、特殊情况处理

手部有可见污染物或沾染微生物培养物必须先用流动清水和肥皂按 “七步洗手法” 清洗,再用75%酒精擦拭双手(作用30秒),确保彻底消毒。无水源时的临时清洁取用足量免洗洗手液(覆盖双手所有区域),按“七步洗手法” 揉搓至完全干燥(约1分钟),操作后尽快找到水源补充水洗。手部有伤口或破损洗手前需用防水创可贴完全覆盖伤口,操作时佩戴双层手套;洗手时动作轻柔,避免创可贴脱落,洗后检查伤口防护是否完好。

五、注意事项

洗手过程中避免水花溅到实验服或实验台表面,若发生溅湿,需用75%酒精及时擦拭消毒。不得用未清洁的手触碰水龙头、门把手等公共设施,洗后若需触碰,可垫用一次性纸巾。

定期检查洗手设施:水龙头是否漏水、肥皂/洗手液是否充足、纸巾是否更换,发现问题及时报告实验室负责人。



附件5


菌种使用操作规程


在BSL-1实验室中,菌种作为核心实验材料,其正确使用对于实验准确性、生物安全及实验环境维护至关重要。本规程适用于BSL-1实验室涉及的所有非致病性、低风险菌种的操作,明确从菌种获取、储存、使用到处置各环节的规范流程,旨在预防菌种污染、交叉传播及意外暴露。

一、菌种采购与验收

(一)供应商选择

必须从具备资质、信誉良好的菌种保藏中心(如中国普通微生物菌种保藏管理中心)或专业生物试剂供应商采购菌种。优先选用经认证、有详细特性说明及质量保证的商业化菌种。

(二)采购流程

采购前需明确所需菌种的学名(拉丁名)、编号、特性(如生长温度、需氧类型)及预期用途。填写采购申请时,注明生物安全等级(BSL-1适用菌种)及特殊运输要求(如冷链、防震)。

(三)验收要点

菌种到货后,立即检查包装完整性,确保无泄漏、破损。核对菌种标签信息(名称、编号、代数、生产日期、保质期)与采购订单一致。若为冻干菌种,观察安瓿管是否有裂缝;冻存管菌种需检查管盖密封情况。首次使用前,需进行菌种活力及纯度预验证(方法见“四、菌种复苏与活化”)。

二、菌种储存

(一)储存设施

短期储存(1—3个月):使用 4℃医用冷藏冰箱,内部需有明确分区(如按菌种类型、代数),避免交叉污染。

长期储存(>3个月):采用-80℃超低温冰箱,存放时将菌种置于专用冻存盒内,标记清晰(菌种名称、编号、冻存日期、代数)。超低温冰箱需定期除霜(每3—6个月1次),确保制冷效果。

(二)储存环境监测

每月定期对冰箱内部进行清洁消毒(75%酒精擦拭),若发现污染,立即停止使用,彻底消毒后重新验证(空载运行24小时,监测温度稳定且无菌)。

三、实验前准备

(一)人员培训与资质

所有涉及菌种操作的人员需接受BSL-1实验室安全培训及菌种使用专项培训,考核合格后方可上岗。每年需参加复训,更新知识与技能。

(二)实验环境准备

操作前30分钟开启超净工作台,进行紫外线照射消毒。使用75%酒精擦拭台面、移液器、接种环等工具表面。确保实验台整洁,仅摆放本次实验所需物品(培养基、菌种管、移液管等)。

(三)培养基及试剂准备

根据菌种特性,选用合适的培养基(如LB培养基用于大肠杆菌、PDA培养基用于霉菌)。培养基配制过程需严格按配方操作,高压灭菌(121℃,15—20分钟)后冷却备用。准备无菌水、生理盐水、75% 酒精、含氯消毒剂(用于污染处理)等试剂。

四、菌种复苏与活化

(一)冻干菌种复苏

1.用75%酒精擦拭冻干菌种安瓿管外壁,放置于超净工作台内。

2.用砂轮在安瓿管颈部划一圈,轻轻折断(避免用力过猛导致玻璃碎片飞溅)。

3.取12mL无菌复苏液(如液体培养基)注入安瓿管,轻轻振荡,使冻干菌种完全溶解。

4.将溶解后的菌液用无菌移液管转移至装有5~10mL液体培养基的试管中,轻柔混匀。

5.将试管置于适宜温度(按菌种特性,如大肠杆菌37℃)的摇床(转速 150~200rpm)或培养箱中培养18—24 小时(或按菌种说明书),观察菌液浑浊度,确认菌种复苏成功。

(二)冻存管菌种活化

1.从超低温冰箱取出冻存管,立即放入37℃水浴中快速解冻(不断摇晃,避免局部过热,约1—2分钟)。

2.用75%酒精擦拭冻存管外壁后,置于超净工作台内。

3.打开冻存管,用无菌移液管吸取适量菌液(100~200μL),接种至固体培养基平板(如营养琼脂平板),采用四区划线法分离单菌落(接种环需在酒精灯火焰上灼烧灭菌,冷却后使用)。

4.将平板倒置放入培养箱,按菌种适宜温度培养24—48小时,挑取单菌落进行后续实验或再次接种至液体培养基扩大培养。

五、菌种使用操作

(一)接种操作

1.固体培养基接种:用灼烧冷却后的接种环挑取菌种(单菌落或菌苔),在固体斜面培养基上从底部向顶部划“Z”字形线,或在平板培养基上进行分区划线(如四区划线、连续划线),以获得单菌落。操作时,试管口或平板开口需靠近酒精灯火焰(保持 10~15cm),避免杂菌污染。

2.液体培养基接种:用无菌移液管吸取适量菌液(一般为液体培养基体积的1%~5%),缓慢注入液体培养基中,轻轻振荡混匀。若使用注射器接种,需选用一次性无菌注射器,针头安装牢固,避免液体泄漏。

(二)培养条件控制

严格按菌种特性设置培养温度、时间、需氧/厌氧条件等参数。例如,好氧菌培养时,摇床转速控制在150~200rpm;厌氧菌需使用厌氧罐或厌氧培养箱,内部气体环境(如 N₂、H₂、CO₂比例)符合菌种要求。培养箱内放置湿度计,保持相对湿度50%~70%(部分对湿度敏感的菌种需严格控制)。

(三)过程监测

培养过程中定期观察(至少每天1次)菌种生长情况,如液体培养基的浑浊度、固体培养基上菌落形态(大小、颜色、边缘、质地)。若发现异常(如杂菌污染、生长缓慢或停滞),立即停止培养,按“六、污染与异常处理”流程处理。

六、污染与异常处理

(一)污染判断

若培养基出现异味、变色、浑浊,或在固体培养基上观察到非目标菌落形态(如不同颜色、形状、质地),可初步判断为污染。通过显微镜镜检(革兰氏染色、芽孢染色等)进一步确认污染微生物类型。

(二)污染处理

立即将污染的菌种及培养基放入专用的高压灭菌袋中,密封后经121℃、15—20分钟高压灭菌处理。对超净工作台、实验台表面用含氯消毒剂(1000mg/L)擦拭消毒2次,每次作用15分钟。若污染严重(如大面积泄漏),需暂停实验区域使用,进行全面清洁消毒(包括地面、墙壁),并对同批次储存的其他菌种进行抽样检测,确认未受污染后方可恢复使用。

(三)异常生长处理

若菌种生长缓慢或不生长,检查培养条件(温度、pH、营养成分)是否正确,尝试更换新鲜培养基或重新复苏活化菌种。记录异常情况及处理过程,分析原因(如菌种退化、保存不当),必要时与供应商沟通寻求解决方案。

七、菌种传代与保存

(一)传代原则

为保持菌种活力与特性,需定期传代。一般情况下,细菌每1—2个月传代1次,霉菌每2—3个月传代1次。传代次数不得超过规定代数(通常从冻干菌种开始,传代不超过5代),避免菌种退化。

(二)传代操作

从培养好的菌种中挑取适量菌体(单菌落或菌液),按“五、菌种使用操作”中的接种方法,转接至新鲜培养基上培养。传代后的菌种需进行纯度和特性验证(如菌落形态观察、显微镜镜检、生化反应测试),合格后方可保存。

(三)保存方法

1.斜面低温保存法:将传代后生长良好的菌种接种至固体斜面培养基,培养至对数生长期后,放入4℃冰箱保存。保存期间需定期检查(每月1次)培养基是否干裂、有无杂菌污染,若发现问题,及时重新传代保存。

2.甘油冻存法:将培养至对数生长期的菌液与无菌甘油按1:1(v/v)混合,使甘油终浓度为15%~20%。分装至冻存管(每管0.5~1mL),标注菌种名称、编号、传代日期、代数等信息,放入- 80℃超低温冰箱长期保存。

八、菌种废弃物处理

(一)废弃物分类

废弃的菌种培养基、菌液、冻干管、冻存管等均属于生物废弃物。按危害程度分为感染性废弃物(含活菌)和损伤性废弃物(如破碎的玻璃安瓿管)。

(二)处理流程

感染性废弃物需装入专用的黄色医疗废物袋,密封后经121℃、30分钟高压灭菌处理,灭菌后按普通垃圾处理。损伤性废弃物(如玻璃碎片)放入防刺穿的锐器盒,密封后高压灭菌,再交由专业医疗废物处理机构处置。

九、管理与记录

(一)专人管理

实验室指定专人负责菌种管理,包括采购、验收、储存、使用监督及废弃物处理协调。管理人员需定期检查菌种库存、储存条件及使用记录,确保流程合规。

(二)记录保存

建立完善的菌种管理记录体系,包括《菌种使用记录表》等。并需保存记录表至少5年,以备追溯和审查。

(三)定期盘点

每季度对菌种库存进行盘点,核对菌种数量、名称、编号、代数与记录是否一致。清理过期、污染或不再使用的菌种,及时补充库存,确保实验需求。


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