注意事项（仪器使用和样品制备） 一、仪器预约与使用 1. 操作资格与培训 操作者必须经过设施管理员的系统性正规培训，并通过理论与实操考核，获得独立操作资格。 2. 提前预约与沟通 预约：严格按照实验室管理系统提前预约，并严格遵守时间安排。 沟通：预约时需详细说明实验关键信息，包括细胞类型、培养板规格、荧光染料/探针种类、实验目的（如活细胞长时间成像、3D球扫描、固定细胞染色等），以便管理员确认实验方案与仪器配置的兼容性。 3. 开机前检查 环境系统检查：确认仪器内置的CO₂气源压力充足、温度控制器工作正常。若进行活细胞实验，需提前开启系统预热与气体平衡。 核心组件检查：确认物镜转盘、滤光片转轮、自动进样器等运动部件运行顺畅，无异常声响。 4. 方法确认 严禁随意修改他人或经过验证的标准实验方法。上机前务必确认所调用成像方法的参数（如物镜倍数、曝光时间、荧光通道、Z轴层扫设置、共聚焦模式等）适用于当前样品，避免因激光功率过高或曝光时间过长导致细胞光漂白或信号饱和。建议使用自己创建并优化保存的方法。 5. 实时监控与数据管理 实时监控：运行实验过程中，需密切观察图像质量、对焦稳定性、细胞状态（活细胞实验） 等。发现图像失焦、信号异常或细胞形态剧变等问题，应立即暂停并查找原因。 数据与卫生：实验结束后，及时将海量图像数据转移至指定存储位置进行备份和分析。清理实验台面，取走自己的样品和废弃物，并用适当清洁剂（如70%乙醇）擦拭载物台，保持仪器周围环境整洁。 二、 样品制备注意事项 1、样品本身 细胞状态与相容性：确保细胞处于良好的生长状态，无支原体污染。细胞种类及所使用的培养板、培养基必须与仪器载物台、物镜及活细胞培养系统兼容。例如，使用高倍水镜时，需确认培养板底板符合要求。 浓度与密度适中：细胞铺板密度需均匀且适中。密度过高会导致细胞重叠，影响单细胞分析；密度过低则统计显著性差，且可能影响细胞正常生长与信号传递。 2. 荧光标记 探针/染料选择与兼容性：所选荧光染料或荧光蛋白的激发/发射光谱必须与仪器配置的激光器和滤光片波段匹配。避免光谱串色，必要时进行光谱 unmixing。 染色浓度与毒性：优化荧光探针的工作浓度。浓度过高可能导致荧光淬灭或细胞毒性，影响活细胞实验结果；浓度过低则信号强度不足。对于多色标记，需确认不同染料之间无化学反应干扰。 设置对照：必须设置未染色对照、单阳对照等，以用于准确设定成像参数和后续分析的阈值。 3. 洁净度与无菌 样品洁净度：确保培养板底板外表面洁净、无指纹、灰尘、液体或结晶，以免严重影响图像质量和自动对焦。 无菌操作：对于活细胞长时间成像，整个制备过程需保持无菌操作，防止微生物污染导致实验失败。 4. 前处理过程 固定与透化：若为固定细胞实验，固定剂（如多聚甲醛）的浓度和作用时间需优化，以充分固定细胞同时避免过度交联影响抗原表位。透化剂（如Triton X-100）的使用也需优化，以平衡膜通透性与细胞结构的保持。 封闭与抗体孵育：使用合适的封闭剂（如BSA）以减少非特异性结合。抗体孵育浓度、时间和温度需经过验证，确保信号特异且强劲。 5. 上机前准备 清晰标识：培养板必须有清晰、唯一的标识，并在软件序列设置中准确记录板架号和实验组别，防止数据混淆。 板盖密封：对于长时间活细胞实验，需使用透气的密封膜，既防止蒸发和污染，又保证气体交换。对于固定细胞样品，可密封板盖以防溶液挥发。 | 
